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摘要:正交實驗法優(yōu)化了超臨界CO2 萃取香椿葉總黃酮的工藝。在原料50 g,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7 MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲罐平衡條件下,超臨界CO2 萃取香椿葉中總黃酮的最佳工藝條件為:萃取壓力30MPa,萃取溫度45 ℃,萃取時間215 h,夾帶劑用量為3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用無水乙醇、后3次用體積分數(shù)為85%的乙醇做夾帶劑。在此條件下1 g香椿葉中提取的總黃酮質(zhì)量為81836 9 mg,總萃取率為51106% ,提取物以總黃酮計的清除2, 22二苯代苦味?；诫禄?DPPH)自由基的IC50為51080 g?g- 1。

關(guān)鍵詞:香椿葉;總黃酮;超臨界CO2 萃取;夾帶劑;中藥現(xiàn)代化。

香椿Toona sinensis (A. Juss. ) Roem 屬楝科(Meliaceae)香椿屬(Toona)落葉喬木[ 1 ] ,材菜兼用,在我國具有悠久的栽培歷史[ 2 ] ,不但是我國特有速生用材樹種[ 3 ] ,而且被國外稱為“綠色保健菜”[ 4 ] 。研究發(fā)現(xiàn)香椿葉含有黃酮類化合物[ 5 ] 。生物類黃酮具有心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性、抗氧化自由基活性,以及抗炎、鎮(zhèn)痛、保肝等多種生物活性[ 6 ] ,特別是具有抗自由基及抗癌、防癌作用,使生物類黃酮在醫(yī)藥、食品領(lǐng)域的應用具有廣闊的前景。因此,黃酮的提取制備技術(shù)的研究具有重要意義。

超臨界流體萃取( SFE)是利用超臨界流體對中藥及天然藥物有效成分進行提取分離的新型技術(shù),與傳統(tǒng)分離提取方法相比,具有產(chǎn)品純度高、收率高,有效成分破壞少,操作簡單、節(jié)能等優(yōu)點,還可通過控制臨界溫度和壓力的變化達到選擇性提取和分離純化的目的。超臨界CO2 萃取,已應用于提取柿葉黃酮[ 7 ] 、藜蒿黃酮[ [ 8 ] 、甘草黃酮[ 9 ] 、銀杏葉黃酮[ 10 ]等,顯示該技術(shù)有良好應用前景。

作者研究了超臨界CO2 提取香椿葉中總黃酮的工藝條件和提取物清除DPPH自由基的能力。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,采用正交實驗方案,以總黃酮得率為主考察指標,提取物以黃酮計的清除DPPH自由基的IC50值為次考察指標,對香椿葉總黃酮的超臨界CO2 單次提取工藝進行了優(yōu)選,結(jié)合提取次數(shù)實驗,確定了香椿葉總黃酮的超臨界CO2 提取工藝。 材料與方法

1．1、儀器、試劑與材料

儀器: HA121 - 50 - 01 型超臨界CO2 萃取裝置,江蘇省南通市華安超臨界萃取有限公司; UV /V IS2802PCS型分光光度計,尤尼柯(上海)儀器有限公司; 7230G可見分光光度計,上海精密科學儀器有限公司; SH IMADZU AY120 型電子分析天平,島津國際貿(mào)易(上海)有限公司; ES - 600型電子天平,長沙湘平科技發(fā)展有限公司; pHS - 3C型精密pH計,上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠。試劑: 2, 22二苯代苦味?；诫禄?DPPH) , C18H12N5O6 ,相對分子質(zhì)量394133, Sigma - Aldrich公司;蘆丁,四川光泰制藥有限公司;體積分數(shù)95 %乙醇,三氯化鋁,醋酸鈉,冰醋酸均為國產(chǎn)AR;食品級CO2 ,長沙高科氣體有限公司; 水為自制新鮮蒸餾水。 材料:所用香椿葉于2005年11月下旬采自中南林業(yè)科技大學株洲校區(qū),由中南林業(yè)科技大學劉克旺教授鑒定為Toona sinensis (A. Juss. ) Roem. 的葉子。采后沖洗并將葉片與葉軸分開,葉片在烘箱中于50 ℃烘至手可捏碎,粉碎過篩,收集過18目篩不過100目篩部分(過100目篩部分另外收集) ,放置干燥避光處密封保存?zhèn)溆谩?nbsp;實驗

1.2.1、檢測方法

采用分光光度法測定,以黃酮計的IC50值表示提取物清除DPPH自由基能力[ 11 ] 。IC50值的物理意義為:當抗氧化劑清除DPPH自由基達到50%清除率時,單位質(zhì)量抗氧化劑所清除DPPH的質(zhì)量。采用改進的AlCl3 顯色分光光度法測定、計算超臨界CO2 萃取物中的黃酮質(zhì)量,標準曲線的制作如下:準確稱取經(jīng)105 ℃干燥至恒重的蘆丁標準試劑01033 5 g,用體積分數(shù)為95%乙醇溶解,并定量轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中,用體積分數(shù)95%乙醇定容,搖勻得質(zhì)量濃度為01335 g?L - 1標準溶液。分別取上述蘆丁標準溶液0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0、 410 mL于25 mL 容量瓶中,分別加入110 mL 015mol?L - 1三氯化鋁水溶液,搖勻放置15 min,用體積分數(shù)95%乙醇定容至刻度,搖勻,超聲振蕩5 min后,選用1 cm比色皿在410 nm波長處測定其吸光度,參比為空白三氯化鋁水溶液。以吸光度A 對蘆丁質(zhì)量濃度ρ作圖,得圖1校準曲線,其回歸方程: A= 0.023 2ρ- 0.023 5, R2 = 0.999 8。線性范圍的蘆丁質(zhì)量濃度為2.68～53.6 mg/L。根據(jù)此標準曲線的回歸方程即可計算出試液的質(zhì)量濃度和提取物中黃酮質(zhì)量。

1.2.2、原料總黃酮含量和含水率的測定

稱取5 g香椿葉2份,分別放入250 mL錐形瓶中,用體積分數(shù)為70%的乙醇作提取劑,第一次和第二次提取的溶劑用量為45 mL,第一次提取時間為90 min,以后每隔1 h提取一次,提取劑用量以剛好浸沒料渣為宜,直到浸提液經(jīng)顯色反應后,其吸光度接近于0為止,參比為空白試劑。合并上述浸提液,采用AlCl3 顯色分光光度法測定提取物中的黃酮量[ 12 ] 。計算得總黃酮量為171306 5 mg/g香椿葉。黃酮提取率=提取出的黃酮質(zhì)量/香椿葉中總黃酮質(zhì)量。  

1.2.3、超臨界萃取

確稱取一定量的原料,裝入料筒放進萃取釜,按工藝要求調(diào)節(jié)好萃取溫度、CO2 流量,待制冷系統(tǒng)和萃取溫度、CO2 流量等達到穩(wěn)態(tài)后,加入設定種類和用量的夾帶劑,開動高壓泵進行循環(huán)萃取操作。從鋼瓶出來的CO2 通過過濾系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)后,經(jīng)高壓泵達到所需壓力,由預熱系統(tǒng)升至所需溫度,然后與原料接觸,被萃取成分溶解在CO2 中,萃取物流進入分離系統(tǒng),通過改變壓力或溫度,降低其在超臨界CO2 流體中的溶解度而被析出,萃取物用接收瓶接收后取樣分析, CO2 氣體經(jīng)流量計計量后返回,再通過過濾系統(tǒng)、制冷系統(tǒng)循環(huán)利用。

1.2.4、超臨界萃取的正交實驗方法

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,考慮安全性及經(jīng)濟性,固定無水乙醇為夾帶劑,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲罐平衡,再以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量、CO2 流量為影響因素,采用正交實驗確定各因素不同水平對萃取結(jié)果及IC50值的影響,選用L16 (45 )正交表進行實驗方案設計。

1.2.5、超臨界萃取的驗證實驗

在正交實驗所得的最佳萃取工藝條件下,平行作兩次驗證實驗。同時在此基礎(chǔ)上作萃取次數(shù)為5次的單因素實驗,尋找較佳的提取次數(shù)。

2、結(jié)果與討論

極差分析

對以上正交實驗結(jié)果作極差分析,結(jié)果如表2示 由表2可看出,各最佳水平按因素主次順序排列為,黃酮提取量: A3 > E3 >D2 >B2 > C1 ;以總黃酮清除DPPH的IC50值: C4 >D4 > A4 > E4 > B3。分析各因素最佳水平順序,以黃酮提取量為主,提取物以黃酮計的清除DPPH的IC50值為次參考指標綜合考慮,可以得到在本實驗條件下單次提取的最佳工藝:A3B2 C1D2 E3 ,即稱取50 g原料,在分離室Ⅰ溫度35℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲罐平衡條件下,以3 mL?g- 1加入無水乙醇做夾帶劑,在萃取壓力30MPa、萃取溫度45 ℃、CO2 流量為35 L?h- 1循環(huán)萃取215 h。

3、結(jié)論

(1)超臨界CO2 萃取香椿葉中黃酮類化合物時,單次提取各因素對黃酮提取量的影響大小次序為:萃取壓力> CO2 流量>夾帶劑用量>萃取溫度>萃取時間。萃取壓力對黃酮提取量影響顯著,但對提取物以黃酮計的清除DPPH的IC50值的影響不顯著;萃取溫度、萃取時間、夾帶劑用量、CO2 流量對黃酮提取量和提取物以黃酮計的清除DPPH的IC50值的影響不顯著。

(2)在原料50 g,分離室Ⅰ溫度35 ℃、壓力7MPa;分離室Ⅱ溫度35 ℃、壓力與儲罐平衡條件下,超臨界CO2 萃取香椿葉中黃酮類化合物的最佳工藝條件為:萃取壓力30MPa,萃取溫度45 ℃,萃取時間215 h,夾帶劑用量為3 mL /g原料, CO2 流量35 L /h,提取5次,前2次用無水乙醇、后3次用體積分數(shù)85%的乙醇做夾帶劑。在此條件下香椿葉黃酮提取量為81836 9 mg/g,總萃取率為51106%,提取物以黃酮計的清除DPPH自由基的IC50為51080 g?g- 1。